Apa Itu PCR? (2)

24 November 2020

294

Muhammad Thamrin Hidayat – Dosen FKIP

Awal perkembangannya PCR DNA polimerase yang digunakan adalah fragmen Klenow DNA polimerase I yang berasal dari Escherichia coli. Fragmen Klenow adalah DNA polimerase yang telah dihilangkan aktivitasnya eksonuklease (5’~3’)nya. Ada beberapa pertimbangkan dalam menggunakan fragmen yaitu kemampuan laju prosesivitasnya dan polimerasasinya. Prosesivitas adalah kemampuan suatu enzim polimerase untuk menggabungkan nukleotida dengan suatu primer secara terus menerus tanpa terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan.

Kelemahan fragmen Klenow DNA polimerase I ini adalah tidak tahan panas, namun memiliki kemampuan laju polimerasasinya termasuk sedang dan juga memiliki prosesivitasnya rendah. Hampir semua kelemahan fragmen-fragmen yang ada mempunyai prosesivitas yang rendah sehingga terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan setelah menggabungkan kurang dari 10 nukleotida, kecuali fragmen T7DNA polimerase yang mampu menggabungkan ribuan nukleotida tanpa terdiosiasidasi komplek primer-DNA cetakan. Untuk mengatasi beberapa kelemahan fragmen polimerasi di atas maka beberapa ilmuwan mencari fragmen polimerase yang memiliki prosesivitasnya dan laju polimerasasi tinggi seperti yang diharapkan, di samping itu juga tahan terhadap panas tinggi. Beberapa enzim polimerase yang sering digunakan beberapa diantaranya:

Tag DNA Polmerase

Pada pelaksanaan denaturasi, suhu yang digunakan sekitar 94⁰-96⁰C . Dengan suhu yang cukup tinggi enzim yang digunakan diharapkan tetap aktif meskipun mengalami inkubasi pada suhu yang tinggi. Oleh sebab itu perlunya dicarikan enzim yang tahan terhadap suhu yang cukup tinggi. Kelemahan yang dimiliki DNA polimerase fragmen Klenow dengan suhu tinggi tersebut akan mengurangi kemampuan enzim untuk bekerja. Alternatif sebagai pengganti fragmen Klenow dalam PCR adalah DNA yang berasal dari mikrobia termofilik yaitu Thermous aquaticus BM, yang akhirnya DNA polimerasenya dikenal dengan Tag DNA polimerase.

Kelebihan enzim Tag DNA polimerase ini adalah:

Mempunyai kemampuan polimerisasi DNA yang cukup tinggi dan tahan terhadap suhu tinggi yang diperlukan untuk memisahkan rantai DNA cetakan.
Pada pH 9 pada suhu 20⁰C kerjanya paling aktif, dan aktifitas optimumnya sekitar 75⁰C – 80⁰
Aktivitas specifik enzim ini dalam menggabungkan nukleotida mencapai 150 nukleotida per detik per molekul enzim.
Waktu paruh Tag DNA polimerase pada suhu 95⁰C adalah 4 menit.
Dengan penambahan radionukleotida, digoxigenin, biotin atau fluorecein dapat digunakan untuk melabel DNA.
Dengan penambahan deterjen non-ionik dan senyawa lain berupa gelatin, gliserol, dan amonium sulfat dapat meningkatkan efisiensi polimerasi enzim Tag DNA polimerase.
Tag DNA polimerase dapat juga digunakan untuk melakukan sekuensing DNA.

Kelemahan enzim TagDNA polimerase ini adalah: mempunyai potensi untuk melakukan kesalahan dalam menggabungkan nukeotida sehingga kemungkinan terjadi mutasi pada fragmen hasil implifikasi. Masih ada beberapa polymerase yang digunakan di dalam pelaksanaan PCR yang memang memiliki karakteristik, keunggulan dan kelemahan masing-masing. Macam-macam polimerase tersebut adalah: Tth DNA Polimerase, Pwo DNA Polimerase, Pfu dan Tli DNA polimerase.

Pada awalnya teknik PCR hanya digunakan untuk mengamplifikasi molekul DNA dengan menggunakan DNA sebagai bahan awal (starting meterial) yang akan digunakan sebagai cetakan, yaitu molekul DNA yang akan amplifikasi harus di isolasi terlebih dahulu dari sel atau jaringan. Perkembangan lebih lanjut dengan menggunakan molekul RNA sebagai bahan awal yaitu dengan teknik Reserve Transcriptase PCR (RT-PCR). Tetapi tidak sampai di sini saja tetapi sekarang tanpa mengisolasi molekul DNA dari sel atau jaringan ataupun menggunakan RT-PCR tetapi dengan jalan teknik yang dikenal dengan PCR In situ. Dengan teknik ini selain efisien tetapi untuk mengaplifikasi molekul DNA yang panjang.

Penggunaan PCR di dalam ilmu forensik diantaranya untuk mengetahui hubungan kekerabatan dari orang yang belum diketahui secara jelas, dapat digunakan dengan metode PCR dengan penanda minisatelit atau yang dikenal dengan Variabel Number Tandem Repeat (VNTR). Hasil dari PCR kemudian di masukkan ke dalam elektroporosis dari sampel keempat individu yang diteliti. Dari hasilnya di dapatkan enam pita yang masing-masing organisme misalnya virus yang akan didentifikasi. Pita terbentuk tergantung besaran pasangan basa (bp) dari masing masing kromosom.

Bila besaran besaran bp sama maka tempat pita akan sama pula. Maka dengan demikian, individu yang berasal dari keturunan yang sama dan mana yang bukan. Demikian pula untuk mengetahui pelaku kejahatan, dengan menggunakan sampel yang berasal dari rambut, bercak darah, semen (cairan sperma), saliva dari pelaku kejahatan dapat diketahui dengan membandingkan pita hasil elektroporosis. Seperti contoh bagan di bawah ini menunjukkan bahwa sampel F adalah milik individu B karena ada 6 pita yang sama dari hasil elektroporosis. Dengan demikian individu F dapat dinyatakan sebagai pelaku kejahatan. Hasil eletroporosis juga dikenal dengan nama DNA fingerprint. Dengan demikian dengan penggunaan metode PCR dan dilengkapi dengan eletroporosis dapat menentukan pelaku kejahatan.

Ditemukan metode PCR yang awalnya sangat rumit pelaksanaannya. Sekarang mudah dalam pelaksanaannya, karena tidak perlu dengan mengisolasi DNA yang akan diuji. Selain itu juga perpaduan dengan beberapa metode PCR berkembang dengan pesat setelah ditemukan karakteristik genom (kromosom) yang ada. Jadi keterangan di atas merupakan awal dari penggunaan PCR, mungkin prosesnya sekarang lebih cepat dan sangat akurat hasilnya untuk memdeteksi organisme tertentu. Di dalam genom ditemukan beberapa kecenderungan tipe polimorfisme. Dengan demikian beberapa metode digunakan dengan adanya kareakteristik genom diantaranya Variabel Number Tanden Repeat (VNTR), Short Tandem Repeat (STR) atau Simple Sequnce Repeat (SSR), Restriction Fragmen Length Polymorphisms (RFLP). Makin berkembang bioteknologi terutama PCR ini maka mudah untuk mendapatkan informasi tentang kekerabatan dan keanekaragaman mahluk hidup di antaranya virus covid19 dengan mudah dan akurat.

Express Your Reaction